Die Meeresbiologin Mary Hagedorn hatte mehr als 20 Jahre lang mit einem scheinbar unlösbaren Problem zu kämpfen. Sie suchte nach einer Möglichkeit, die Embryonen von Zebrafischen einzufrieren und aufzutauen.
Als wichtiges Versuchstier kommen die Zebrafischgene den Genen des Menschen so nahe, dass sie zur Untersuchung von Krankheiten wie Muskeldystrophie und Melanom eingesetzt wurden. Wenn das Fortpflanzungsmaterial leicht eingefroren und aufgetaut werden könnte, wären diese Studien einfacher durchzuführen und zu replizieren, da sich die Forscher nicht mit Laichplänen oder dem Kampf gegen genetische Drift auseinandersetzen müssten.
Das Problem liegt in der Art und Weise, wie sich Fische vermehren. Wissenschaftler haben erfolgreich eingefroren - oder kryokonserviert, um den Fachbegriff zu verwenden - und lebensfähige Spermien und Eier von vielen Tieren über Jahrzehnte hinweg aufgetaut. Aber Fischeier entwickeln sich außerhalb des Körpers der Eltern, was physiologische Herausforderungen mit sich bringt, die nicht auftreten, wenn Sie mit Zellen von Rindern oder sogar von Menschen arbeiten. Das Ei enthält die Nährstoffe, die der sich entwickelnde Embryo benötigt, und hat auch eine eigene Rüstung, was bedeutet, dass diese Eier groß sind und oft in einer relativ undurchlässigen Membran eingeschlossen sind.
Einfach ausgedrückt, sind die Fischeier unter normalen Umständen zu groß, um schnell einzufrieren oder aufzutauen. Hagedorn, der als Forschungsbiologe beim Zentrum für Artenüberleben des Smithsonian National Zoo and Conservation Biology Institute arbeitet, vergleicht sie mit Planeten. Säugetiereier ähneln normalerweise eher den winzigeren Mitgliedern unseres Sonnensystems - etwa dem Merkur. Ein Zebrafischei ist einem Riesen wie Jupiter näher.
"Wenn Sie das Gewebe nicht richtig einfrieren, bilden sich darin Eiskristalle, die in die Zellen eindringen und diese zerstören", sagt Hagedorn.
Sie suchte 12 Jahre lang nach einer Lösung, um dieses Problem zu lösen, und entschied sich schließlich für eine neuartige Lösung, bei der ein „Kryoprotektivum“ (im Grunde genommen ein Frostschutzmittel) in die Eier injiziert wurde. Diese Technik ermöglichte es dem Wirkstoff, die Schutzmembran zu umgehen. Diese Schutzmittel sind richtig kalibriert, um eine Vergiftung der Zellen zu vermeiden. Sie können dazu beitragen, dass ein Ei beim Eintauchen in ein Bad mit flüssigem Stickstoff gleichmäßig verglast (glasartig) wird.
„Wenn Sie das Gewebe nicht richtig einfrieren, bilden sich darin Eiskristalle, die in die Zellen eindringen und diese zerstören“, beschreibt Mary Hagedorn das Problem, mit dem sie beim Einfrieren von Zebrafischembryonen konfrontiert war. (Enzyklopädie des Lebens / Biobilder) Während dieser Prozess Fischembryonen effektiv in einen Zustand suspendierter Animation versetzen konnte, blieb das erneute Erhitzen ein Problem. Während sie sich erwärmen, gibt es einen Zwischenpunkt zwischen dem idealen glasartigen Zustand und der Raumtemperatur, an dem sich wieder Eiskristalle bilden können. Und diese Kristalle können das Zellmaterial schädigen, so dass es nicht mehr weiterentwickelt werden kann.
"Wir mussten sie viel schneller auftauen", sagte Hagedorn. „Mit den Tools, die wir 2011 hatten. . . Ich bin gegen eine Wand gestoßen. “
Für eine Weile gab sie auf.
Und so hätte es wohl auch bleiben können, wenn sie 2013 nicht zufällig auf einer Kryokonservierungskonferenz eine Präsentation von John Bischof, einem Professor für Maschinenbau an der Universität von Minnesota, gehört hätte.
Wie Bischof berichtet, hatte er über ein nicht verwandtes Thema mit Eisenoxid-Nanopartikeln berichtet, das sein Labor zur sicheren Erwärmung von menschlichem Gewebe für die Transplantation verwendet hatte. Seine Forschung stieß bei Hagedorn auf großes Interesse und veranlasste sie, über das Potenzial für Anwendungen außerhalb von Säugetieren nachzudenken.
„Sie sagte: Was können Sie tun, um mir mit den Embryonen zu helfen“, erinnert sich Bischof.
Aus dieser Ausgangsfrage entstand eine komplexe, fortlaufende interdisziplinäre Zusammenarbeit, in der sowohl Hagedorn als auch Bischof auf der Bedeutung der Arbeit des anderen bestehen.
Ihre Ergebnisse, die diese Woche in der Zeitschrift ACS Nano veröffentlicht wurden, deuten darauf hin, dass es schließlich möglich sein könnte, gefrorene Fischembryonen sicher aufzuwärmen.
Die Inspiration für ihre Arbeit kam von einem inzwischen verstorbenen Wissenschaftler namens Peter Mazur, der glaubte, dass es möglich sein könnte, gefrorene Embryonen mit Lasern aufzuwärmen. (Ja, Laser.) Obwohl die Idee potenziell fundiert war, ist es laut Hagedorn eine Herausforderung, Laser dazu zu bringen, Wärme auf biologisches Material zu übertragen. Zusammen mit einem anderen Forscher namens Fritz Kleinhans fand Mazur jedoch heraus, dass es möglich sein könnte, mit dem Embryo eine andere Substanz in die Lösung einzuführen, die Wärme vom Laser aufnimmt und sie auf die biologische Substanz überträgt.
In Mazurs Fall bedeutete dies Ruß in Form von Tusche, eine Substanz, die Wärme gut aufnimmt und leitet - und die man laut Kleinhans einfach bei Amazon.com kaufen kann. Wenn es zum Beispiel um einen gefrorenen Mausembryo gelegt würde, könnte ein einzelner Laserpuls das Zellmaterial fast augenblicklich auf Raumtemperatur bringen und die Zwischenphase der Erwärmung umgehen, in der sich Eiskristalle zu bilden drohen. Kleinhans sagte, dass sie in der frühen Phase von Hagedorns Arbeit gehofft hatte, dass die Technik auch für Zebrafisch-Embryonen funktionieren könnte. Leider waren sie immer noch zu groß, und als die äußere Hitze ins Zentrum gelangte, bildeten sich bereits tödliche Eiskristalle.
Wie Hagedorn, Bischof und ihre Mitarbeiter in ihrer neuen Arbeit schreiben, gab es jedoch einen anderen Weg. Das Verteilen von Tusche auf der Außenseite des Embryos hat vielleicht nicht gereicht, aber was ist, wenn sie vor dem Einfrieren anderes ansprechendes Material hineingelegt haben? Dazu setzten sie sich mit Goldnanostäben ab - winzige Molekülstrukturen, die um Größenordnungen kleiner sind als ein menschliches Haar -, die sie zusammen mit Frostschutzmitteln vor der Konservierung in den Embryo mikroinjizierten, wobei sie die Methoden verwendeten, die Hagedorn Jahre zuvor ausgearbeitet hatte.
Wie die Forscher in ihrer Arbeit schreiben: „Diese Nanopartikel können effektiv Wärme erzeugen, wenn die Laserwellenlänge mit der Oberflächenplasmonresonanzenergie des Goldnanopartikels übereinstimmt.“ Das ist eine komplizierte Art zu sagen, dass die Nanostäbe die Energie eines kurzen Lichtblitzes absorbieren und verstärken könnten.
Gold zeigt, wie viele andere Substanzen, im Nanomaßstab andere Eigenschaften als in großen Mengen. Ein gut kalibrierter Millisekunden-Laserpuls kann einen Embryo plötzlich über das darin verteilte Gold aufheizen und es mit einer erstaunlichen Geschwindigkeit von 1, 4 x 10 7 ° C pro Minute wieder aufheizen die Forscher beschäftigen.
„In diesem Millisekunden-Puls des Lasers geht man von flüssigem Stickstoff auf Raumtemperatur über“, sagt Bischof. Bezeichnenderweise waren die Ergebnisse anders als bei jeder anderen Methode, die Hagedorn zuvor versucht hatte, heiß genug - und weit genug verbreitet -, um einen ganzen Zebrafischembryo auf einmal erfolgreich aufzuheizen.
Nachdem diese Grenze überschritten war, blieben Fragen offen. Entscheidend dabei war, ob diese Embryonen noch lebensfähig sind. Wie die Forscher in ihrer Arbeit berichten, war ein erheblicher Teil davon, wenn auch nicht alle. Von denen, die sie aufgetaut hatten, schafften es 31 Prozent nur eine Stunde nach dem Aufwärmen, 17 Prozent überschritten die Drei-Stunden-Marke und nur 10 Prozent entwickelten sich noch nach der 24-Stunden-Marke.
Das klingt zwar klein, ist aber weitaus größer als die Null-Prozent-Überlebensrate, die frühere Methoden erbracht hatten. Hagedorn hofft, dass die zukünftige Arbeit diese Zahlen weiter verbessern wird. Und sie bleibt auch in Bezug auf die 10-Prozent-Zahl positiv. "Ein Fisch kann Millionen von Eiern produzieren, und wenn ich 10 Prozent davon erfolgreich einfrieren würde, wäre das eine wirklich gute Zahl", sagt sie.
Natürlich würde das Auseinandersetzen mit Millionen von Eiern erfordern, dass sie den Prozess für die Effizienz weiter transformieren. Zu diesem Zeitpunkt liegt ein Großteil dieser Arbeit bei Bischof und anderen in seinem Labor, wo bereits daran gearbeitet wird, den „Durchsatz“ des Prozesses zu verbessern und ihn möglicherweise zu einem industrielleren Unterfangen zu machen. "Ich denke, es wird eine Reihe von Technologien geben, die in den kommenden Jahren dafür entwickelt werden", sagte er mir.
Wenn diese Arbeit gelingt, glaubt Hagedorn, dass sie andere Verwendungen haben könnte, die weit über den bescheidenen Zebrafisch hinausgehen.
"Viele Aquakulturbauern wollen Fisch [Fortpflanzungsmaterial] einfrieren, weil sie nur einmal im Jahr laichen", sagte sie. „Sie haben diesen Boom-and-Bust-Aspekt, wenn Sie ihre Farmen betreiben. Wenn Sie die Embryonen planmäßiger aus dem Gefrierschrank nehmen könnten, würde dies das Essen billiger und zuverlässiger machen. “
Dies kann sich auch auf den Artenschutz auswirken. Hagedorn, der heute hauptsächlich an Korallen arbeitet, glaubt, dass es uns helfen könnte, beschädigte Riffe zu reparieren. Sie schlägt auch vor, dass es letztendlich abgereicherte Froschpopulationen wiederherstellen und möglicherweise auch andere Arten retten könnte. Unabhängig davon, wohin uns die Arbeit in Zukunft führt, ist sie ein Beweis für das Potenzial der wissenschaftlichen Zusammenarbeit von heute.
„Anfangs fühlte es sich ehrlich gesagt nicht echt an. Es ist biologisch sinnvoll, dass wir es schaffen, aber es schien, als würden wir niemals alle Teile zusammenbringen “, sagte sie mir. „Wenn ich mich bei diesem Treffen nicht neben John gesetzt hätte, hätten wir das nie getan. Ohne unsere gemeinsamen Anstrengungen - das Engineering und die Biologie - wäre das nicht passiert. “
